Kuljar

BAB I

PENDAHULUAN

A.    Latar belakang

Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril.

Berdasarkan bagian-bagian tanaman yang dikulturkan secara spesifik terdapat beberapa Macam kultur:

1. Kultur organ, yaitu kultur yang diinisiasi dari organ-organ tanaman seperti: pucuk terminal dan aksilar, meristem, daun, batang, ujung akar, bunga, buah muda, embrio, dan sebagainya.

2. Kultur kalus, yaitu kultur sekumpulan sel yang tidak terorganisir, hanya sel-sel parenkim yang berasal dari bahan awal.

3. Kultur suspensi, yaitu kultur sel bebas atau agregat sel kecil dalam media cair. Pada umumnya kultur suspensi diinisiasi dari kalus.

4. Kultur protoplas, yaitu kultur sel-sel muda yang diinisiasi dalam media cair yang dihilangkan dinding selnya. Kultur protoplas digunakan untuk hibrididasi somatik (fusi dua protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik).

5. Kultur haploid (kultur mikrospora/ anther), yaitu kultur dari kepala sari (kultur anther) atau tepung sari (kultur mikrospora).Dalam makalah akan dibahas selengkapnya mengenai kultur jarinagan dari suspensi sel.

B.     Rumus Masalah

A.    Apakah pengertian kultur suspensi sel ?

B.     Bagaimana sejarah perkembangan kultur suspensi sel ?

C.     Bagaiman tehnik yang digunakan untuk melakukan suspensi ?

D.    Bagaiman cara melakukan kultur suspensi sel ?

BAB II

PEMBAHASAN

Bioteknologi adalah suatu bidang penerapan biosains dan teknologi yang menyangkut penerapan praktis organisme hidup atau komponen subselulernya pada industri jasa dan manufaktur suatu pengolahan lingkungan. Bioteknologi memanfaatkan bakteri,ragi,kapang,alga sel, tumbuhan atau sel jaringan yang dibiakkan sebagai konstituen berbagai proses industri. Penerapan bioteknologi yang berhasil hanya tercapai bila dilakukan pengintegrasian berbagai disiplin ilmu pengetahuan dan teknologi termasuk mikrobiologi, biokimia, genetika, biomolekuler, kimia serta rekayasa proses dan tehnik kimia misalnya kultur jaringan.

Kultur jaringan adalah suatu sistem pengembangbiakan tanaman dengan menggunakan bagian-bagian tanaman yang berukuran kecil sampai sangat kecil baik berupa organ, jaringan, maupun sel-sel tanaman dalam media buatan dengan kondisi yang aseptis secara in vitro, kemudian beregenerasi menjadi tanaman lengkap.

A.    Pengertian Kultur Suspensi Sel

            Kultur suspensi sel adalah pemeliharaan sel, tunggal maupun gabungan beberapa sel, dalam medium cair dan lingkungan buatan yang steril. Kultur suspensi sel terdiri atas populasi sel dengan laju pertumbuhan yang cepat karena seluruh permukaan sel dapat kontak langsung dengan medium nutrisi. Hal ini menyebabkan metabolisme sel lebih tinggi jika dibandingkan dengan kultur kalus.

            Metode kultur suspensi sel dapat digunakan sebagai sarana untuk produksi metabolit sekunder. Hal ini dapat terjadi karena setiap sel tumbuhan yang diisolasi dari tumbuhan induknya mempunyai potensi genetik dan fisiologi yang sama dengan induknya, atau yang dikenal dengan nama sifat totipotensi. Sifat ini menyebabkan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tanaman induk dapat pula dihasilkan pada sel yang dikultur secara in vitro.

            Pelaksanaan teknik kultur jaringan ini berdasarkan teori sel seperti yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwann, yaitu bahwa sel mempunyai kemampuan autonom, bahkan mempunyai kemampuan totipotensi. Totipotensi adalah kemampuan setiap sel, darimana saja sel tersebut diambil, apabila diletakkan dalam lingkungan yang sesuai akan dapat tumbuh menjadi tanaman yang sempurna. Kultur suspensi sel merupakan hasil dari kultur kalus, dimana kalus biasanya didefinisikan untuk kumpulan sel – sel yang belum berdiferensiasi, jika ini dipisahkan dalam kultur cair maka disebut kultur suspensi. Kultur suspensi sel dapat dimanfaatkan untuk memproduksi suatu zat langsung dari sel tanpa membentuk tanaman lengkap baru. Zat - zat bisa meliputi massa sel atau ekstrak bahan kimia. Kultur seperti ini serupa dengan kultur mikroorganisme. Sel – sel yang digunakan dapat direkayasa secara genetik untuk meningkatkan sintesa zat tertentu.

            Kultur suspensi sel dapat diperoleh dengan cara memindahkan kalus dari medium padat ke medium cair dalam kondisi agitasi selama periode kultur dalam waktu tertentu. George & Sherrington (1984) menyatakan bahwa dalam kondisi agitasi, kalus meremah akan terpisah membentuk kelompok sel dan sel-sel tunggal. Sel-sel tunggal akan mengadakan pembelahan membentuk kelompok-kelompok sel yang kemudian terpisah lagi membentuk sel-sel tunggal dan kelompok-keompok sel yang lebih kecil. agitasi dalam kultur suspensi sel dapat meningkatkan aerasi, reduksi polaritas tanaman dan dapat mempertahankan keseragaman distribusi sel-sel dan kelompok sel di dalam medium. Dijelaskan oleh Endress (1994) bahwa agitasi atau pengocokan pada kultur suspensi sel dapat mempengaruhi ukuran agregat, viabilitas dan pertumbuhan sel. Selain itu pengocokan berfungsi untuk meningkatkan oksigen.

B.     Sejarah Perkembangan Suspensi  Sel

Perkembangan kultur jaringan dimulai dari pembuktian sifat totipotensi sel yang dikemukakan oleh Schwann dan Schleiden (1838). Gothlieb Haberlandt (1902) seorang botanis yang dipandang sebagai pelopor kultur jaringan, mengemukakan hipotesis bahwa sel tanaman yang diisolasi dan dikondisikan pada lingkungan yang sesuai akan tumbuh dan berkembang menjadi tanaman yang lengkap. Folke dan Skoog pada 1940-an menemukan bahwa zat pengatur tumbuh auksin, yaitu IAA dan NAA yang sebelumnya diketahui dapat merangsang pertumbuhan akar, ternyata dapat merangsang pertumbuhan in-vitro tetapi menghambat pertumbuhan mata tunas. Pada 1951 Skoog dkk menemukan bahwa senyawa fosfat anorganik dan senyawa organik adenin atau adenosin dapat merangsang pertumbuhan mata tunas. Pada 1955 Carlos Miller dkk (juga bekerjasama dengan Skoog) menemukan kinetin, satu penemuan pertama hormon sitokinin. Pada 1957 Skoog dan Miller mempublikasikan penemuannya tentang hubungan antara sitokinin dan auksin dalam mengontrol pembentukan akar dan tunas dalam kultur jaringan tanaman. Tosshio Murashige dan Skoog (1962) mempublikasikan formulasi media yang sampai sekarang cocok untuk kultur jaringan banyak tanaman dan digunakan secara luas di laboratorium kultur jaringan di dunia. Penggunaan teknik kultur jaringan untuk memproduksi tanaman bebas virus bermula dari penemuan Morel dan Martin (1952) yang memperoleh tanaman dahlia bebas virus dengan mengkulturkan meristem pucuk tanaman yang terinfeksi virus.

C.    Tehnik Yang Dilakukan Dalam Kultur  Suspensi  Sel

Ada beberapa macam tehnik pemisahan sel yang digunakan dalam kultur suspensi,yaitu:

1.      Isolasi sel Yang dimaksud dengan isolasi sel adalah proses pengambilan suatu partikel sel dari tempat asalnya untuk diteliti lebih lanjut. Sel dapat diisolasi dari suspensi jaringan.

2.      Isolasi sel dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu:

a.       Fluorescence-Activated Cell Sorter

Prinsip metode ini ialah menggunakan antibodi yang berikatan dengan zat fluoresen untuk melabel sel spesifik. Suspensi sel dilewatkan pada sinar laser dan dibaca oleh detektor. Suspensi yang mengandung sel diberi sinyal positif atau negatif bergantung pada selnya mengandung zat fluoresen atau tidak. Suspensi kemudian melewati aliran listrik dan dipisahkan ke tempat masing-masing sesuai muatannya.

b.      Laser Capture Microdissection

            Prinsip metode ini menggunakan laser untuk memotong bagian tertentu dan memindahkannya ke tempat lain, contohnya memisahkan sel tumor dari jaringannya.

3.   Pembiakan sel Setelah diisolasi, sel ditumbuhkan (diperbanyak) dengan cara invitro (menggunakan media) atau in vivo (melibatkan sel hidup). Ada 2 macam biakan atau kultur, yaitu biakan primer dan biakan sekunder. Biakan primer ialah biakan yang diambil langsung dari jaringan organisme tanpa proliferasi sel secara in vitro. Sementara itu, biakan sekunder ialah biakan yang dikembangbiakkan dari biakan primer, biasanya di-refresh dalam jangka waktu tertentu.

4. Hibridisasi sel

     Sel hibrid adalah gabungan dua sel berbeda yang dengan hasil akhir satu inti sel. Tujuan dibuatnya sel hibrid adalah untuk membentuk antibodi monoklonal.

5. Fraksinasi sel

Fraksinasi sel ialah pemisahan sel menjadi organel dan molekul, biasa dilakukan dengan sentrifugasi. Sentifugasi merupakan tahap pertama dalam fraksinasi, memisahkan organel berdasarkan ukuran dan densitasnya. Prinsip sentrifugasi ialah bahwa untuk memperoleh organel yang besar, diperlukan kecepatan sentrifugasi yang rendah, dan sebaliknya. Peningkatan produksi artemisinin dalam kultur suspensi sel artemisia annua l. Melalui elisitasi dengan ekstrak ragi.

D.    Cara Melakukan Suspensi  Sel

Pelaksanaan kultur suspensi sel biasanya dimulai dengan mengsubkultur potongan kalus ke media cair, kecuali itu kultur suspensi juga dapat menggunakan potongan organ (seperti hipokotil, kotiledon dan lain-lain) sebagai ekplan hanya saja teknik ini memerlukan waktu yang lebih lama. Pembelahan sel secara bertahap akan terlepas dari sel induk bebas bergerak di dalam inokulum karena adanya gerakan dari medium. Setelah beberapa saat kultur akan tersusun atas sel tunggal, kumpulan sel (agregate cellular) dengan ukuran yang bervariasi, sisa potongan eksplan dan sisa-sisa sel mati. Dalam kultur kalus dan suspensi sel dikenal istilah friabel yang maksudnya adalah sel-sel terpisah setelah mengalami pembelahan sel. Bentuk suspensi sel yang bagus adalah kultur yang persentasi kandungan sel tunggal dan kumpulan sel-sel kecilnya tinggi.

Derajat pemisahan sel pada kultur telah dicirikan adanya sifat friabilitas dari sel tersebut, sifat tersebut dapat dimunculkan atau diinduksi dengan merubah komposisi unsur hara media. Seperti pada penambahan auksin dari pada sitokinin pada beberapa masalah dapat memacu produksi sel yang friabel. Namun sebaliknya ada beberapa kultur malah menjadi terhambat proses friabilitasnya. Jadi tidak ada prosedur standar yang dapat direkomendasikan untuk memulai kultur suspensi sel dari kalus, maka untuk memilih kondisi yang sesuai harus melakukan coba-coba (trial and error).

Untuk mengkultur kalus ke kultur suspensi, pertama kali dibutuhkan kalus seberat 2-3 g per 100 cm3. Pertumbuhan jumlah sel akan mengikuti pertambahan eksponensial dan linier dalam populasi sel. Lama-lama kecepatan pembelahan sel akan melambat dan akhirnya akan mencapai fase diam atau stationary. Agar sel tetap dapat tumbuh maka pada awal fase diam sel-sel harus disubkultur pada media yang baru. Setiap jenis tanaman akan mempunyai panjang waktu fase pertumbuhan dan fase diam yang berbeda-beda. Pada kebanyakan kultur suspensi kerapatan optimum akan tercapai pada umur 18-25 hari setelah tanam dan fase sel paling aktif pada umur 6-9 hari setelah tanam.

Prosedur Suspensi sel yang dilakukan di laboratorium kultur jaringanadalah sebagai berikut :

1. Persiapan media, sebab media adalah faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf.

2.  Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan.Eksplan diambil dari batang antar ruas kedua lau ditanam pada medium dengan penambahan NAA 1 mg/l, BAP 0,5 mg/l, dan 5% ekstrak yeast. Empat minggu setelaqh penanaman kalus akan terbentuk. Kalus yang diperoleh ada 2 macam. Pada permukaan berupa kalus yang friable/remah,sedangkan bagian dalam relative kompak. Untuk kalus yang friable dapat langsung dipindah ke media cair, diletakkan pada shaker dan di inkubasi untuk diikuti perkembangannya. Perbanyakan dari sel dapat diikuti setiap 2 hari sekali, dengan cara mengambil sampelnya (0,5 ml) untuk dihitung dengan menggunakan haemocytometer. Sedangkan untuk kalus yang relative kompak, diberi perlakuan terlebih dahulu untuk memisahkan sel satu dengan yang lain. Pemisahan sel dapat dilakukan dengan cara merendam kalus pada larutan pektinase yang diberi senyawa osmotikum. Pektinase yang digunakan adalah meserozyme R10 1 %, ditambah 0,3 %mannitol. Kalus direndam selama 1 malam. Kemudian suspensi sel disentrifugasi pada kecepatan 750 nrpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pellet disuspensikan kembali dengan media cair serta disentrifugasi kembali dengan kecepatan dan waktu yang sama. Proses ini diulang 2-3 kali untuk menghilangkan larutan enzim. Setyelah itu diresuspensi kembali dengan 2 ml media cair, untuk kemudian ditanam pada media cair, kemudaian diletakkan pada shaker dan diinkubasi. Penggunaan medium cair mempunyai beberapa keunggulan dibandingkan medium padat, antara lain pada medium padat kalus yang tumbuh akan mengalami gradien difusi terhadap nutrien di dalam medium dan gas di dalam kalus akan menyebabkan pertumbuhan dan metabolismenya mengalami perubahan. Agar itu sendiri akan melepas senyawa kimia ke dalam medium kultur dan kalus akan mensekresi sisa-sisa metabolisme ke dalam medium yang dapat meracuni pertumbuhan kalus itu sendiri. Pada medium cair keberadaan oksigen adalah terlarut dalam cairan medium, untuk memperolehnya maka medium harus digoyang (agitatic).

             

3. Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.

4.  Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow yang bertujuan untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.

5. Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).

6. Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.

Kultur suspense sel diinisiasi dari kalus yang remah dan ditumbuhkan pada medium cair yang diberi aerasi. Pemberian aerasi dilakukan dengan menggunakan meja penggojok (shaker) yang dioperasikan secara terus-menerus, dengan kecepatan berkisar 90-100 rpm.

1.      Bahan dan alat

Bahan-bahan yang diperlukan untuk aplikasi kultur suspense sel, yaitu a. kalus wortel yang remah, b. alcohol 70%, c. air steril dan medium MS cair yang mengandung 4,5 µM 2,4-D.

            Alat-alat yang digunakan yaitu laminar air flow, cawan petri, lampu spiritus, gelas piala, pipet + pipet filler, Erlenmeyer 250 ml, alat-alat tanam (pinset,tangkai scalpel dan pisau scalpel), spatula steril, timbangan analitik kecil dan saringan 80-µM steril.

2.      Cara kerja

Semua prosedur dilaksanakan secara aseptic dalam LAFC. Kalus wortel ditimbang sebanyak 250 mg, lalu dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi medium MS cair kira-kira 30 mL. Selanjutnya, Erlenmeyer diletakkan di atas meja penggojog dalam ruang kultur dengan intensitas cahaya 50 µmol m­^-2 s^-1 dan fotoperiodesitas 16 jam.

Setelah tampak adanya perkembangan kultur (kira-kira dua minggu setelah inisiasi), yang dicirikan oleh makin banyaknya agregat-agregat sel yang melayang di dalam medium, dekantasikan suspense kultur 30-60 menit untuk mengendapkan agregat sel yang besar. Kemudian lakukan penyaringan terhadap suspense sel menggunakan saringan 80 µm steril dan tampunglah filtratnya dalam Erlenmeyer steril. Filtrat hasil penyaringan diambil kira-kira 5 mL, lalu dipindahkan ke medium baru dengan komposisi sama, seperti medium sebelumnya. Selanjutnya, kultur dikembalikan ke meja penggojog dalam ruang kultur seperti sebelumnya. Pengamatan dilakukan terhadap peubah-peubah, seperti pembentukan kalus dan embryogenesis somatik.

BAB III

KESIMPULAN

            Kultur sel tanaman adalah teknik budidaya sel tanaman dalam suatu lingkungan yang terkendali dan dalam keadaan aseptik atau bebas mikroorganisme. Pelaksanaan teknik kultur jaringan ini berdasarkan teori sel seperti yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwann, yaitu bahwa sel mempunyai kemampuan autonom, bahkan mempunyai kemampuan totipotensi. Kultur sel ini biasanya ditanam dalam bentuk suspensi dengan kepadatan tertentu. Sel-sel ini umumnya diambil dari kalus, agar membentuk agregat kecil atau sel tunggal maka kalus dimasukkan dalam media cair kemudian disentrifugasi berulang atau bisa juga dengan prosedur enzimatik.Tujuan kultur jarinagan suspensi sel adalah menghasilkan budidaya tanaman secara cepat yang mempunyai sifat seperti induknya.

DAFTAR PUSTAKA

http://liliksetiono.wordpress.com/2009/05/05/bioteknologi/

http://www.dephut.go.id/INFORMASI/setjen/PUSSTAN/info_5_1_0604/isi_11.htm

Hendaryono Daisy P Sriyanti  dan Ari Wijayani. Teknik Kultur Jaringan. Yogyakarta: Kanisius.2006

Lianah,Pengantar Bioteknologi,2008

Muslim Ahmadi.  kultur suspensi sel, http://bloginvitro.blogspot.com

Munfarida Ida. kultur kalus dan kultur suspensi sel, http://wordPress.com

Mastegar. Teknik kultur Jaringan, http://blogatize.com

Yunita, Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efesien.

Jakarta : Agromedia Pustaka.2004