BAB I
PENDAHULUAN
A.
Latar
belakang
Kultur jaringan merupakan salah satu
cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik
perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata
tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara
aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang
tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi
menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah
perbayakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan
media buatan yang dilakukan di tempat steril.
Berdasarkan
bagian-bagian tanaman yang dikulturkan secara spesifik terdapat beberapa Macam
kultur:
1. Kultur
organ, yaitu kultur yang diinisiasi dari organ-organ tanaman seperti: pucuk
terminal dan aksilar, meristem, daun, batang, ujung akar, bunga, buah muda,
embrio, dan sebagainya.
2. Kultur kalus,
yaitu kultur sekumpulan sel yang tidak terorganisir, hanya sel-sel parenkim
yang berasal dari bahan awal.
3. Kultur
suspensi, yaitu kultur sel bebas atau agregat sel kecil dalam media cair. Pada
umumnya kultur suspensi diinisiasi dari kalus.
4. Kultur
protoplas, yaitu kultur sel-sel muda yang diinisiasi dalam media cair yang
dihilangkan dinding selnya. Kultur protoplas digunakan untuk hibrididasi
somatik (fusi dua protoplas baik intraspesifik maupun interspesifik).
5. Kultur
haploid (kultur mikrospora/ anther), yaitu kultur dari kepala sari (kultur
anther) atau tepung sari (kultur mikrospora).Dalam makalah akan dibahas
selengkapnya mengenai kultur jarinagan dari suspensi sel.
B.
Rumus
Masalah
A.
Apakah
pengertian kultur suspensi sel ?
B.
Bagaimana
sejarah perkembangan kultur suspensi sel ?
C.
Bagaiman
tehnik yang digunakan untuk melakukan suspensi ?
D.
Bagaiman
cara melakukan kultur suspensi sel ?
BAB
II
PEMBAHASAN
Bioteknologi
adalah suatu bidang penerapan biosains dan teknologi yang menyangkut penerapan
praktis organisme hidup atau komponen subselulernya pada industri jasa dan
manufaktur suatu pengolahan lingkungan. Bioteknologi memanfaatkan
bakteri,ragi,kapang,alga sel, tumbuhan atau sel jaringan yang dibiakkan sebagai
konstituen berbagai proses industri. Penerapan bioteknologi yang berhasil hanya
tercapai bila dilakukan pengintegrasian berbagai disiplin ilmu pengetahuan dan
teknologi termasuk mikrobiologi, biokimia, genetika, biomolekuler, kimia serta
rekayasa proses dan tehnik kimia misalnya kultur jaringan.
Kultur
jaringan adalah suatu sistem pengembangbiakan tanaman dengan menggunakan
bagian-bagian tanaman yang berukuran kecil sampai sangat kecil baik berupa
organ, jaringan, maupun sel-sel tanaman dalam media buatan dengan kondisi yang
aseptis secara in vitro, kemudian beregenerasi menjadi tanaman lengkap.
A.
Pengertian
Kultur Suspensi Sel
Kultur suspensi sel adalah
pemeliharaan sel, tunggal maupun gabungan beberapa sel, dalam medium cair dan
lingkungan buatan yang steril. Kultur suspensi sel terdiri atas populasi sel
dengan laju pertumbuhan yang cepat karena seluruh permukaan sel dapat kontak
langsung dengan medium nutrisi. Hal ini menyebabkan metabolisme sel lebih
tinggi jika dibandingkan dengan kultur kalus.
Metode kultur suspensi sel dapat
digunakan sebagai sarana untuk produksi metabolit sekunder. Hal ini dapat
terjadi karena setiap sel tumbuhan yang diisolasi dari tumbuhan induknya
mempunyai potensi genetik dan fisiologi yang sama dengan induknya, atau yang
dikenal dengan nama sifat totipotensi. Sifat ini menyebabkan metabolit sekunder
yang dihasilkan oleh tanaman induk dapat pula dihasilkan pada sel yang dikultur
secara in
vitro.
Pelaksanaan teknik kultur jaringan ini berdasarkan teori sel
seperti yang dikemukakan oleh Schleiden dan Schwann, yaitu bahwa sel mempunyai
kemampuan autonom, bahkan mempunyai kemampuan totipotensi. Totipotensi adalah
kemampuan setiap sel, darimana saja sel tersebut diambil, apabila diletakkan
dalam lingkungan yang sesuai akan dapat tumbuh menjadi tanaman yang sempurna.
Kultur suspensi sel merupakan hasil dari kultur kalus, dimana kalus biasanya
didefinisikan untuk kumpulan sel – sel yang belum berdiferensiasi, jika ini
dipisahkan dalam kultur cair maka disebut kultur suspensi. Kultur suspensi sel
dapat dimanfaatkan untuk memproduksi suatu zat langsung dari sel tanpa
membentuk tanaman lengkap baru. Zat - zat bisa meliputi massa sel atau ekstrak
bahan kimia. Kultur seperti ini serupa dengan kultur mikroorganisme. Sel – sel
yang digunakan dapat direkayasa secara genetik untuk meningkatkan sintesa zat
tertentu.
Kultur suspensi sel dapat diperoleh
dengan cara memindahkan kalus dari medium padat ke medium cair dalam kondisi
agitasi selama periode kultur dalam waktu tertentu. George & Sherrington
(1984) menyatakan bahwa dalam kondisi agitasi, kalus meremah akan terpisah
membentuk kelompok sel dan sel-sel tunggal. Sel-sel tunggal akan mengadakan
pembelahan membentuk kelompok-kelompok sel yang kemudian terpisah lagi
membentuk sel-sel tunggal dan kelompok-keompok sel yang lebih kecil. agitasi
dalam kultur suspensi sel dapat meningkatkan aerasi, reduksi polaritas tanaman
dan dapat mempertahankan keseragaman distribusi sel-sel dan kelompok sel di
dalam medium. Dijelaskan oleh Endress (1994) bahwa agitasi atau pengocokan pada
kultur suspensi sel dapat mempengaruhi ukuran agregat, viabilitas dan
pertumbuhan sel. Selain itu pengocokan berfungsi untuk meningkatkan oksigen.
B.
Sejarah
Perkembangan Suspensi Sel
Perkembangan
kultur jaringan dimulai dari pembuktian sifat totipotensi sel yang dikemukakan
oleh Schwann dan Schleiden (1838). Gothlieb Haberlandt (1902) seorang botanis
yang dipandang sebagai pelopor kultur jaringan, mengemukakan hipotesis bahwa
sel tanaman yang diisolasi dan dikondisikan pada lingkungan yang sesuai akan
tumbuh dan berkembang menjadi tanaman yang lengkap. Folke dan Skoog pada
1940-an menemukan bahwa zat pengatur tumbuh auksin, yaitu IAA dan NAA yang
sebelumnya diketahui dapat merangsang pertumbuhan akar, ternyata dapat
merangsang pertumbuhan in-vitro tetapi menghambat pertumbuhan mata tunas. Pada
1951 Skoog dkk menemukan bahwa senyawa fosfat anorganik dan senyawa organik
adenin atau adenosin dapat merangsang pertumbuhan mata tunas. Pada 1955 Carlos
Miller dkk (juga bekerjasama dengan Skoog) menemukan kinetin, satu penemuan
pertama hormon sitokinin. Pada 1957 Skoog dan Miller mempublikasikan
penemuannya tentang hubungan antara sitokinin dan auksin dalam mengontrol
pembentukan akar dan tunas dalam kultur jaringan tanaman. Tosshio Murashige dan
Skoog (1962) mempublikasikan formulasi media yang sampai sekarang cocok untuk
kultur jaringan banyak tanaman dan digunakan secara luas di laboratorium kultur
jaringan di dunia. Penggunaan teknik kultur jaringan untuk memproduksi tanaman
bebas virus bermula dari penemuan Morel dan Martin (1952) yang memperoleh
tanaman dahlia bebas virus dengan mengkulturkan meristem pucuk tanaman yang
terinfeksi virus.
C.
Tehnik
Yang Dilakukan Dalam Kultur
Suspensi Sel
Ada beberapa
macam tehnik pemisahan sel yang digunakan dalam kultur suspensi,yaitu:
1.
Isolasi
sel Yang dimaksud dengan isolasi sel adalah proses pengambilan suatu partikel
sel dari tempat asalnya untuk diteliti lebih lanjut. Sel dapat diisolasi dari
suspensi jaringan.
2.
Isolasi
sel dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu:
a.
Fluorescence-Activated
Cell Sorter
Prinsip metode ini ialah menggunakan antibodi yang berikatan dengan
zat fluoresen untuk melabel sel spesifik. Suspensi sel dilewatkan pada sinar
laser dan dibaca oleh detektor. Suspensi yang mengandung sel diberi sinyal
positif atau negatif bergantung pada selnya mengandung zat fluoresen atau
tidak. Suspensi kemudian melewati aliran listrik dan dipisahkan ke tempat masing-masing
sesuai muatannya.
b.
Laser
Capture Microdissection
Prinsip metode ini
menggunakan laser untuk memotong bagian tertentu dan memindahkannya ke tempat
lain, contohnya memisahkan sel tumor dari jaringannya.
3.
Pembiakan
sel Setelah diisolasi, sel ditumbuhkan (diperbanyak) dengan cara invitro
(menggunakan media) atau in vivo (melibatkan sel hidup). Ada 2 macam biakan
atau kultur, yaitu biakan primer dan biakan sekunder. Biakan primer ialah
biakan yang diambil langsung dari jaringan organisme tanpa proliferasi sel
secara in vitro. Sementara itu, biakan sekunder ialah biakan yang
dikembangbiakkan dari biakan primer, biasanya di-refresh dalam jangka waktu
tertentu.
4. Hibridisasi sel
Sel hibrid adalah gabungan dua sel berbeda
yang dengan hasil akhir satu inti sel. Tujuan dibuatnya sel hibrid adalah untuk
membentuk antibodi monoklonal.
5. Fraksinasi sel
Fraksinasi sel
ialah pemisahan sel menjadi organel dan molekul, biasa dilakukan dengan
sentrifugasi. Sentifugasi merupakan tahap pertama dalam fraksinasi, memisahkan
organel berdasarkan ukuran dan densitasnya. Prinsip sentrifugasi ialah bahwa
untuk memperoleh organel yang besar, diperlukan kecepatan sentrifugasi yang
rendah, dan sebaliknya. Peningkatan produksi artemisinin dalam kultur suspensi
sel artemisia annua l. Melalui elisitasi dengan ekstrak ragi.
D.
Cara
Melakukan Suspensi Sel
Pelaksanaan
kultur suspensi sel biasanya dimulai dengan mengsubkultur potongan kalus ke
media cair, kecuali itu kultur suspensi juga dapat menggunakan potongan organ
(seperti hipokotil, kotiledon dan lain-lain) sebagai ekplan hanya saja teknik
ini memerlukan waktu yang lebih lama. Pembelahan sel secara bertahap akan
terlepas dari sel induk bebas bergerak di dalam inokulum karena adanya gerakan
dari medium. Setelah beberapa saat kultur akan tersusun atas sel tunggal,
kumpulan sel (agregate cellular) dengan ukuran yang bervariasi, sisa potongan
eksplan dan sisa-sisa sel mati. Dalam kultur kalus dan suspensi sel dikenal
istilah friabel yang maksudnya adalah sel-sel terpisah setelah mengalami
pembelahan sel. Bentuk suspensi sel yang bagus adalah kultur yang persentasi
kandungan sel tunggal dan kumpulan sel-sel kecilnya tinggi.
Derajat
pemisahan sel pada kultur telah dicirikan adanya sifat friabilitas dari sel
tersebut, sifat tersebut dapat dimunculkan atau diinduksi dengan merubah
komposisi unsur hara media. Seperti pada penambahan auksin dari pada sitokinin
pada beberapa masalah dapat memacu produksi sel yang friabel. Namun sebaliknya
ada beberapa kultur malah menjadi terhambat proses friabilitasnya. Jadi tidak
ada prosedur standar yang dapat direkomendasikan untuk memulai kultur suspensi
sel dari kalus, maka untuk memilih kondisi yang sesuai harus melakukan
coba-coba (trial and error).
Untuk
mengkultur kalus ke kultur suspensi, pertama kali dibutuhkan kalus seberat 2-3
g per 100 cm3. Pertumbuhan jumlah sel akan mengikuti pertambahan eksponensial
dan linier dalam populasi sel. Lama-lama kecepatan pembelahan sel akan melambat
dan akhirnya akan mencapai fase diam atau stationary. Agar sel tetap dapat
tumbuh maka pada awal fase diam sel-sel harus disubkultur pada media yang baru.
Setiap jenis tanaman akan mempunyai panjang waktu fase pertumbuhan dan fase
diam yang berbeda-beda. Pada kebanyakan kultur suspensi kerapatan optimum akan
tercapai pada umur 18-25 hari setelah tanam dan fase sel paling aktif pada umur
6-9 hari setelah tanam.
Prosedur
Suspensi sel yang dilakukan di laboratorium kultur jaringanadalah sebagai
berikut :
1.
Persiapan media, sebab media adalah faktor penentu dalam perbanyakan dengan
kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman
yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam
mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan
seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang
ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan
tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan
pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media juga harus disterilkan dengan
cara memanaskannya dengan autoklaf.
2. Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari
bagian tanaman yang akan dikulturkan.Eksplan diambil dari batang antar ruas
kedua lau ditanam pada medium dengan penambahan NAA 1 mg/l, BAP 0,5 mg/l, dan
5% ekstrak yeast. Empat minggu setelaqh penanaman kalus akan terbentuk. Kalus
yang diperoleh ada 2 macam. Pada permukaan berupa kalus yang
friable/remah,sedangkan bagian dalam relative kompak. Untuk kalus yang friable
dapat langsung dipindah ke media cair, diletakkan pada shaker dan di inkubasi
untuk diikuti perkembangannya. Perbanyakan dari sel dapat diikuti setiap 2 hari
sekali, dengan cara mengambil sampelnya (0,5 ml) untuk dihitung dengan
menggunakan haemocytometer. Sedangkan untuk kalus yang relative kompak, diberi
perlakuan terlebih dahulu untuk memisahkan sel satu dengan yang lain. Pemisahan
sel dapat dilakukan dengan cara merendam kalus pada larutan pektinase yang
diberi senyawa osmotikum. Pektinase yang digunakan adalah meserozyme R10 1 %,
ditambah 0,3 %mannitol. Kalus direndam selama 1 malam. Kemudian suspensi sel
disentrifugasi pada kecepatan 750 nrpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan
pellet disuspensikan kembali dengan media cair serta disentrifugasi kembali
dengan kecepatan dan waktu yang sama. Proses ini diulang 2-3 kali untuk
menghilangkan larutan enzim. Setyelah itu diresuspensi kembali dengan 2 ml
media cair, untuk kemudian ditanam pada media cair, kemudaian diletakkan pada
shaker dan diinkubasi. Penggunaan medium cair mempunyai beberapa keunggulan
dibandingkan medium padat, antara lain pada medium padat kalus yang tumbuh akan
mengalami gradien difusi terhadap nutrien di dalam medium dan gas di dalam
kalus akan menyebabkan pertumbuhan dan metabolismenya mengalami perubahan. Agar
itu sendiri akan melepas senyawa kimia ke dalam medium kultur dan kalus akan
mensekresi sisa-sisa metabolisme ke dalam medium yang dapat meracuni
pertumbuhan kalus itu sendiri. Pada medium cair keberadaan oksigen adalah
terlarut dalam cairan medium, untuk memperolehnya maka medium harus digoyang
(agitatic).
3. Sterilisasi
adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat
yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril.
Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang
disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang
melakukan kultur jaringan juga harus steril.
4. Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak
calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di
laminar flow yang bertujuan untuk menghindari adanya kontaminasi yang
menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami
ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan
suhu kamar.
5. Pengakaran
adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang
menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan
baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan
perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun
jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna
putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).
6. Aklimatisasi
adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng.
Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan
sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan
hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap
serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan
lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan
bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif.
Kultur suspense
sel diinisiasi dari kalus yang remah dan ditumbuhkan pada medium cair yang
diberi aerasi. Pemberian aerasi dilakukan dengan menggunakan meja penggojok
(shaker) yang dioperasikan secara terus-menerus, dengan kecepatan berkisar
90-100 rpm.
1.
Bahan
dan alat
Bahan-bahan
yang diperlukan untuk aplikasi kultur suspense sel, yaitu a. kalus wortel yang
remah, b. alcohol 70%, c. air steril dan medium MS cair yang mengandung 4,5 µM
2,4-D.
Alat-alat yang
digunakan yaitu laminar air flow, cawan petri, lampu spiritus, gelas piala,
pipet + pipet filler, Erlenmeyer 250 ml, alat-alat tanam (pinset,tangkai
scalpel dan pisau scalpel), spatula steril, timbangan analitik kecil dan
saringan 80-µM steril.
2.
Cara
kerja
Semua prosedur
dilaksanakan secara aseptic dalam LAFC. Kalus wortel ditimbang sebanyak 250 mg,
lalu dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi medium MS cair kira-kira 30 mL.
Selanjutnya, Erlenmeyer diletakkan di atas meja penggojog dalam ruang kultur
dengan intensitas cahaya 50 µmol m-2 s-1 dan
fotoperiodesitas 16 jam.
Setelah tampak
adanya perkembangan kultur (kira-kira dua minggu setelah inisiasi), yang
dicirikan oleh makin banyaknya agregat-agregat sel yang melayang di dalam
medium, dekantasikan suspense kultur 30-60 menit untuk mengendapkan agregat sel
yang besar. Kemudian lakukan penyaringan terhadap suspense sel menggunakan
saringan 80 µm steril dan tampunglah filtratnya dalam Erlenmeyer steril.
Filtrat hasil penyaringan diambil kira-kira 5 mL, lalu dipindahkan ke medium
baru dengan komposisi sama, seperti medium sebelumnya. Selanjutnya, kultur
dikembalikan ke meja penggojog dalam ruang kultur seperti sebelumnya.
Pengamatan dilakukan terhadap peubah-peubah, seperti pembentukan kalus dan
embryogenesis somatik.
BAB III
KESIMPULAN
Kultur sel tanaman
adalah teknik budidaya sel tanaman dalam suatu lingkungan yang terkendali dan
dalam keadaan aseptik atau bebas mikroorganisme. Pelaksanaan teknik kultur
jaringan ini berdasarkan teori sel seperti yang dikemukakan oleh Schleiden dan
Schwann, yaitu bahwa sel mempunyai kemampuan autonom, bahkan mempunyai
kemampuan totipotensi. Kultur sel ini biasanya ditanam dalam bentuk suspensi
dengan kepadatan tertentu. Sel-sel ini umumnya diambil dari kalus, agar
membentuk agregat kecil atau sel tunggal maka kalus dimasukkan dalam media cair
kemudian disentrifugasi berulang atau bisa juga dengan prosedur enzimatik.Tujuan
kultur jarinagan suspensi sel adalah menghasilkan budidaya tanaman secara cepat
yang mempunyai sifat seperti induknya.
DAFTAR PUSTAKA
http://liliksetiono.wordpress.com/2009/05/05/bioteknologi/
http://www.dephut.go.id/INFORMASI/setjen/PUSSTAN/info_5_1_0604/isi_11.htm
Hendaryono
Daisy P Sriyanti dan Ari Wijayani. Teknik
Kultur Jaringan. Yogyakarta: Kanisius.2006
Lianah,Pengantar
Bioteknologi,2008
Muslim
Ahmadi. kultur suspensi sel, http://bloginvitro.blogspot.com
Munfarida Ida. kultur
kalus dan kultur suspensi sel, http://wordPress.com
Mastegar. Teknik
kultur Jaringan, http://blogatize.com
Yunita, Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efesien.
Jakarta : Agromedia Pustaka.2004
0 komentar:
Posting Komentar